실험원리
헤모글로빈 전기영동은 다양한 정상 및 비정상 헤모글로빈을 검출하고 확인하는 것을 목표로 합니다.
서로 다른 헤모글로빈 유형의 서로 다른 전하 및 등전점으로 인해 특정 pH 완충 용액에서 헤모글로빈의 등전점이 완충 용액의 pH보다 낮을 때 헤모글로빈은 음전하를 띠고 전기 영동 중에 양극쪽으로 이동합니다. 반대로 양전하를 띤 헤모글로빈은 음극쪽으로 이동합니다.
특정 전압 하에서 특정 전기영동 시간이 지나면 전하와 분자량이 다른 헤모글로빈은 이동 방향과 속도가 다릅니다. 이를 통해 별개의 구역을 분리할 수 있으며, 이러한 구역에서 후속 비색 또는 전기영동 스캐닝 분석을 수행하여 다양한 헤모글로빈을 정량화할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 pH 8.6 셀룰로오스 아세테이트 막 전기영동입니다.
세포질 내에서 글리코겐 또는 다당류 물질(예: 점액다당류, 점액단백질, 당단백질, 당지질 등)에 존재하는 에틸렌 글리콜 그룹(CHOH-CHOH)은 과요오드산에 의해 산화되어 알데히드 그룹(CHO-CHO)으로 전환됩니다. 이러한 알데히드 그룹은 무색의 자홍색 Schiff 시약과 결합하여 세포에 다당류가 존재하는 곳에 침전되는 자색-빨간색 염료를 형성합니다. 이 반응은 이전에는 글리코겐 염색으로 불렸던 PAS(과요오드산-쉬프) 염색으로 알려져 있습니다.
실험방법
재료:셀룰로오스 아세테이트기억브레인, 전기영동장치(DYCP-38C 및 전원공급장치 DYY-6C), 우수한 샘플 로딩 도구(피펫), 분광 광도계, 비색 큐벳, 버퍼.
완충기:
(1) pH 8.6 TEB 완충액: 트리스 10.29g, EDTA 0.6g, 붕산 3.2g을 달아 증류수를 넣어 1000ml로 한다.
(2) 붕산염 완충액 : 붕사 6.87g과 붕산 5.56g을 달아 증류수를 넣어 1000ml로 한다.
절차:
P헤모글로빈 용액의 복구
항응고제로 헤파린이나 구연산나트륨이 함유된 혈액 3ml를 섭취합니다. 2000rpm에서 10분간 원심분리하고 혈장을 버립니다. 적혈구를 생리식염수로 3회 세척합니다(750rpm, 매번 5분 원심분리). 2200rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 버립니다. 동량의 증류수를 첨가한 후, 사염화탄소를 0.5배 부피로 첨가한다. 5분 동안 세게 흔든 후 2200rpm에서 10분 동안 원심분리하여 나중에 사용하기 위해 상부 Hb 용액을 수집합니다.
멤브레인 담그기
셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 3cm × 8cm 크기의 스트립으로 자릅니다. 완전히 포화될 때까지 pH 8.6 TEB 완충액에 담근 다음 제거하고 여과지로 닦아 건조시킵니다.
스포팅
피펫을 사용하여 가장자리에서 약 1.5cm 떨어진 셀룰로오스 아세테이트 막(거친 면)에 수직으로 헤모글로빈 용액 10 μl를 위치시킵니다.
전기영동
붕산염 완충액을 전기영동 챔버에 붓습니다. 챔버의 음극 끝 부분에 얼룩진 면이 있는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 놓습니다. 200V에서 30분간 실행합니다.
용출
HbA 구역과 HbA2 구역을 잘라내어 별도의 시험관에 넣고 증류수를 각각 15ml와 3ml를 첨가합니다. 가볍게 흔들어 헤모글로빈을 완전히 용출시킨 후 혼합하세요..
측색법
용출액으로 증류수를 사용하여 흡광도를 0으로 하고 415nm에서 흡광도를 측정한다.
계산
HbA2(%) = HbA2 튜브의 흡광도 / (HbA 튜브의 흡광도 × 5 + HbA2 튜브의 흡광도) × 100%
실험 결과 계산
pH 8.6 TEB 완충액 셀룰로오스 아세테이트 전기영동의 기준 범위: HbA > 95%, HbA2 1%-3.1%
메모
전기영동 시간은 너무 길면 안 된다. 셀룰로오스 아세테이트 막은 전기영동 중에 건조되어서는 안 됩니다. HbA와 HbA2가 명확하게 분리되면 전기영동을 중지합니다. 장기간 전기영동을 하면 밴드 확산과 흐려짐이 발생할 수 있습니다.
너무 많은 샘플을 사용하지 마십시오. 과도한 헤모글로빈 액체는 밴드 분리 또는 불충분한 염색으로 이어질 수 있으며, 이로 인해 HbA 수치가 잘못 상승할 수 있습니다.
단백질로 인해 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 오염되는 것을 방지합니다.
전류가 너무 높아서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 헤모글로빈 밴드가 분리되지 않을 수 있습니다.
항상 정상인의 검체와 필요한 것으로 알려진 비정상 헤모글로빈의 검체를 대조군으로 포함하십시오.
Beijing Liuyi Biotechnology는 모델인 헤모글로빈 전기영동용 전문 전기영동 탱크를 제조합니다.DYCP-38C셀룰로오스 아세테이트 막 전기 영동 탱크, 셀룰로오스 아세테이트 막 전기 영동 탱크에 사용할 수 있는 전기 영동 전원 공급 장치에는 두 가지 모델이 있습니다.DYY-2C그리고DYY-6C전원 공급 장치.
한편, Beijing Liuyi Biotechnology는 고객에게 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 제공하며 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인의 크기는 맞춤 설정할 수 있습니다. 샘플과 추가 정보를 요청해 주셔서 감사합니다.
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게시 시간: 2023년 9월 20일